Bakterien Schnelltest

Vor allem sollte das Messverfahren eine wesentlich raschere und genauere Ermittlung ermöglichen. Um dieses Problem zu lösen, werden neue Methoden und Geräte für den qualitativen Bakteriennachweis angeboten. Grundlage der Innovation ist eine Vermessung der gekennzeichneten Bakterien, bei der das gewonnene Meßsignal mit der Gesamtkeimzahl der in der Probensubstanz vorliegenden Bakterien in Beziehung gesetzt wird.

Die Bakterien können z.B. durch Lumineszenz, Fluoreszenz oder Ramanstrahlung nachgewiesen werden. Der erste Teil der Entwicklung bezieht sich auf ein Methode zur mengenmäßigen Bestimmung von Bakterien in einer Probensubstanz, die die folgenden Stufen umfasst: a) Inkubation der zu prüfenden Proben mit einem Markierungsreagens, das in der Lage ist, an die zu prüfenden Bakterien zu binden, bevorzugt aus einem fluoreszierenden Markierungsreagens, einem lumineszenten Markierungsreagens und einem Raman-Markierungsreagens aus, und

b) Entfernung von Markierungsreagens, das nicht an die Bakterien gebunden ist, aus den Bakterien durch eine für die zu untersuchenden Bakterien wasserundurchlässige und für das Markierungsreagens permeable Membrane, worin die zu untersuchenden Bakterien auf der Membrane aufgefangen werden, d) mengenmäßiges Bewerten des Meßsignals aus Schritt (c). Die erfinderische Methode ermöglicht eine rasche und mengenmäßige Keimbestimmung in einer Entnahme.

Sie kann unmittelbar nach der Probenahme und ohne vorhergehende Kultur der zu untersuchenden Bakterien erfolgen. Für die Anbindung des Etikettenreagenzes an die Bakterien beträgt die erforderliche Brutzeit möglichst zwischen einer Sekunden und höchstens fünf min, am besten bis zu einem Maximum von 2,5 min. Dadurch kann eine Gesamtmesszeit von weniger als zehn bzw. weniger als fünf Metern erreicht werden.

Die Methode wird bevorzugt für die quantitative Analyse von Legionella eingesetzt. Aber auch andere Bakterien können nachgewiesen werden, im Besonderen menschliche pathogene Bakterien wie z. B. Sulmonellen, Glyzinien, coliforme Bakterien wie E. coli, z. B. EHEC, oder Hospitalkeime wie MRSA. Es kann sich bei der zu bestimmenden Bakterienprobe um eine Wisch- oder Wischprobe, aber auch um eine Bioprobe, z.B. eine Nahrungsmittelprobe von Fleisch, Milch oder Eiern, oder um eine Körpermedium wie z. B. Körperflüssigkeiten wie z. B. Vollblut, Plasmabrennstoff, Serum, Harn, etc. handeln. Die Probestückung kann auch eine Bioprobe sein.

Der Nachweis der Bakterien nach dem erfinderischen Prinzip wird mit einem Markierungsreagens durchgeführt, das an die zu untersuchenden Bakterien binden kann und ein Signal aus dem an die Bakterien bindenden Markierungsreagens misst. Der Nachweis kann z.B. durch Lumineszenzanalyse, Fluoreszenzanalyse und/oder durch Ramanstrahlungsmessung, z.B. durch oberflächenverstärkte Ramanspektroskopie (SERS) durchgeführt werden.

Es wird ein an die zu bestimmenden Bakterien bindendes Markierungsreagens eingesetzt, bevorzugt ein fluoreszierendes, lumineszierendes oder Raman-aktives Markierungsreagens, das für die zu bestimmenden Bakterien selektiv ist, d.h. eine an oder in den zu bestimmenden Bakterien vorhandene Molekülstruktur erkennen lässt, die in anderen Komponenten der Prüflingsprobe nicht auftritt. Das Markierungsreagens kann z. B. aus beschrifteten Nukleinsäure-Sonden, Antigenen, Bakterien und deren Kombination gewählt werden.

Als Markierungsreagens wird ein gekennzeichneter Bakterienphagen empfohlen. Ein fluoreszierendes oder lumineszierendes Markierungsreagens kann in einer Version eingesetzt werden, das fluoreszierende oder lumineszierende Strahlung z.B. im Spektralbereich von 200 Nanometern bis 22 Nanometern, vor allem von 200 Nanometern bis 14 Nanometern ausgibt. Die besonders bevorzugten Emissions-Wellenlängen bewegen sich im Wellenlängenbereich von 1300-1500 Nanometer, fluoreszenz- oder luminismarkierte Nukleinsäure-Sonden, die zur Hybridierung mit ergänzenden antibakteriellen Nukleinsäure-Sequenzen eingesetzt werden, sind allgemein bekannt und werden z.B. für die FISH-Technik eingesetzt.

So können sie z. B. gegen Ribosomen-RNA und/oder DNA-Sequenzen gerichtet sein, die für das zu entdeckende Bakterienmaterial charakteristisch sind. Beschriftete Antigene, z.B. Fluoreszenz- oder Leuchtspiegel beschriftete Antigene, d.h. polyclonale oder monoclonale Antigene, sowie Antiköperfragmente oder Derivate, die gegen ein bakteriumspezifisches Antikörperantigen, z.B. ein auf der bakteriellen Oberfläche angeordnetes Antikörperantigen gerichtetet sind, sind ebenfalls bekannt.

Das Markierungsreagens kann in einer anderen, besonders präferierten Form ein Bakterienphagen sein, der eine Kennzeichnung aufweist, z.B. eine fluoreszierende oder lumineszierende Kennzeichnung, und insbesondere die Oberflächenstruktur auf dem zu untersuchenden Bakterienmaterial wiedergibt. Bakterien für Legionella sind z.B. in Lammetyn (Microb. Beispielsweise sind in Atterbury et al. Bakterien für Salmonellen zu finden (Appl.

Die Bakterienphagen der Listerien werden beispielsweise von Klumpp & Loessner (www. Ncbi. Nlm. nih. gov>PMC3827098) aufbereitet. Bakterienphagen für MRSA zum Beispiel finden sich in Sahin et al. (Mikrobiol. Bul. Bakterien für E. coli, z.B. T-Phagen, Lambda-Phagen oder andere, sind in Simbrook et al (Molecular Cloning, A Laboratory Manual) zu finden. Bei dem erfinderischen Vorgehen werden bevorzugt beschriftete Bakterien, z.B. Fluoreszenz- oder Lumineszenz- beschriftete Bakterien, eingesetzt, die über die zu erfassenden Bakterien hinausgehen.

In der Regel wird festgestellt, dass unter diesen Umständen jede bakterielle Zelle mit etwa 50-400 Phage besetzt ist, besonders mit etwa 50-250 oder 50-150 Phage. So kann zum Beispiel eine E. coli-Bakterienzelle mit etwa 70 Phasen beschichtet werden. Bei einem anderen Vorzugsdesign kann ein mittels Raman-Spektroskopie detektierbares Etikettenreagenz eingesetzt werden, z.B. ein Etikettenreagenz, das ein oberflächenveredeltes Raman-spektroskopisch wirksames Teilchen mitbringt.

Das Markierungsreagens besteht bevorzugt aus einem metallischen Teilchen, z.B. einem Gold- oder Silberteilchen und/oder einem Reportermolekül von Raman, das an eine Probe angebunden ist, die an die zu detektierenden Bakterien bindet. Wie oben bereits erwähnt, kann die Probe aus Nucleinsäuren, Antikoerpern und Bakterien gewaehlt werden, die selektuell an die zu untersuchenden Bakterien bindet. Dabei können die Fluoreszenz- oder Fluoreszenzgruppen des Markierungsreagenzes aus allen gängigen linearen optischen oder mineralischen Fluoreszenz- oder Fluoreszenzfarbstoffen gewählt werden, die bevorzugt im kovalenten Zustand an das markierende Reagenz angebunden sind.

Die zu detektierenden Bakterien werden mit dem Markierreagenz in einer Reaktorkammer inkubiert. Dazu wird die zu prüfende Probensubstanz in die Reaktorkammer eingeführt. Der Markierungsstoff kann vor oder nach der Einführung in die erste Zelle mit der Probensubstanz in Berührung kommen. In der ersten Zelle ist bevorzugt ein Lager mit einer vorgegebenen Anzahl des Markierungsreagenzes vorzusehen, das dort in flüssigem oder trockenem Zustand vorhanden sein kann.

Bevorzugt ist das Markierreagenz in Trockenform erhältlich und kann nach Berührung mit der Probelösung rekonstituiert werden. In der ersten Zelle, in der die zu untersuchenden Bakterien mit dem Etikettierreagenz inkubiert werden, ist auf zumindest einer der Seiten durch eine Membrane zu binden. Oder die mit dem Markierreagenz vermischte Probenmenge kann aus der Brutkammer in eine andere durch eine Membrane begrenzte Brennkammer geführt werden.

Sie ist für die zu untersuchenden Bakterien wasserundurchlässig, aber für das Etikettierreagenz, d.h. für ein nicht an Bakterien bindendes Etikettierreagenz, nachweisbar. So hat diese Membrane z. B. einen Innendurchmesser von ca. 0,5-15 pm, z. B. 13-14 pm. Bei der Bestimmung nach der Erfindung wird in bevorzugter Ausführung eine Meßzelle mit wenigstens zwei Kammer und einer zwischen den Kammer angeordneten Membrane eingesetzt, die für die zu untersuchenden Bakterien wasserundurchlässig und für Markierungsreagenzien ungebunden an die zu untersuchenden Bakterien permeabel ist.

So kann die Meßzelle zum Beispiel eine erste Inkubationskammer und eine zweite Messkammer zur Aufbewahrung getrennter Probenkomponenten und Überschussmarkierungen beinhalten, die wie oben beschrieben über eine Membrane verbunden sind. Am Ende der Inkubationszeit wird das nicht an die Bakterien gebundene Markerreagenz durch die Membrane abgetrennt und die zu untersuchenden Bakterien werden auf der Membrane aufgefangen.

Dies kann durch Anwendung von negativem Druck auf die Membrane erreicht werden, so dass die mit der Membrane in Berührung kommende Probe und das ungebundene Markierungsreagens die Membrane passieren und die Bakterien auf der Membrane aufgefangen werden. Andererseits können Probeflüssigkeit und ungebundenes Markierungsmittel durch Zentrifugieren entfernt werden.

Bevorzugt wird die von den Bakterien getrennte Probeflüssigkeit und das ungebundene Markierreagenz in eine zweite Zelle hinter der Membran geführt. In der Inkubationszeit kann vor oder/und während der Inkubationszeit eine gleichmäßige Vermischung des Markierungsreagenzes mit der zu prüfenden Probenmenge durchgeführt werden. Die gekennzeichneten Bakterien können nach der Inkubationszeit ein- oder mehrfach gespült werden.

In der ersten zur Bebrütung vorgesehenen Brennkammer kann ein Probevolumen mit einer ausreichenden Anzahl von Bakterien für eine mengenmäßige Analyse aufgenommen werden. Die erfinderische Methode basiert auf einer Ermittlung des an die erfassten Bakterien gekoppelten Etikettenreagenzes durch Messen einer für die Etikettengruppe typischen Strahlungscharakteristik, z.B. Fluoreszenz, Lumineszenz und/oder Ramsstrahl.

Dazu wird Anregerlicht aus einer Quelle auf die angesammelten Bakterien gestrahlt und die Fluoreszenz-, Lumineszenz- und/oder Ramanstrahlung des Markierungsreagenzes auf die Bakterien abgelesen. Bei bevorzugter Ausführung werden die aufgefangenen Bakterien nach Entfernung der Probeflüssigkeit und des überflüssigen Markierungsreagenzes unmittelbar auf der Membrane geprüft und ggf. ein oder mehrere Waschschritte durchgeführt.

Die bevorzugte Lichtart ist ein einfacher Roboter, z.B. ein quantenkaskadierter Strahl. In Kombination mit einem entsprechenden optischen System ermöglicht dieser Hochleistungslaser die Befeldung der aufgenommenen Bakterien, am besten über die gesamte Oberfläche der aufgenommenen Bakterien, am besten über die gesamte Oberfläche der auf der Membran aufgenommenen Bakterien. Das an die Bakterien gebundene Markierungsreagens kann durch Fluoreszenzspektroskopie, bevorzugt Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie und/oder Ramanspektroskopie bestimmt werden.

Das von der Lichtquelle kommende Anregerlicht wird mittels einer geeigneten Konfokaloptik in die Probenoberfläche gebündelt, um ein Anregende Volumen zu generieren, in dem sich die zu untersuchenden Bakterien aufhalten. Dabei wird die vom an die Bakterien gebundene Bestrahlung des Etikettenreagenzes, z.B. Fluoreszenz, Leuchtspuren und/oder Ramanstrahlung, mit einem Fotodetektor abgelesen.

Bevorzugt wird ein Spektralphotometer als Fotodetektor eingesetzt, das eine Spektralauflösung des ausgestrahlten Lichtes über einen Spektralbereich von mind. 50 Nanometer, mind. 100 Nanometer und bis zu 200 oder 250 Nanometer erlaubt. Bevorzugt wird ein Fotodetektor, z.B. ein Spectrometer mit einem Messfeld zwischen 200 und 2000 Nanometern, zum Einsatz gebracht.

Das Spektrometer hat eine spektrale Auflösungsrate von 0,35-1 nm, bevorzugt etwa 0,6-0,9 nm. Mit einer Version werden die gekennzeichneten Bakterien durch oberflächengestützte Ramanspektroskopie (SERS) nachweisbar. Das Resultat ist die Zahl der Bakterien in der zu prüfenden Proben, die mit der ermittelten Fluoreszenz, Lumineszenz und/oder Ramanstrahlung übereinstimmt. Ausgehend von der analysierten Bakterienzahl ergibt sich ein bestimmter Anteil an Kolonie bildenden Aggregaten (CFU) pro Probevolumen.

Ausgehend vom Messsignal kann die anhand von Messsignalen ermittelte Keimzahl anhand von Referenzwerten in eine oder mehrere Klassen eingeteilt werden. Übersteigt die Zahl bestimmter Bakterien diesen Grenzwert, sind Massnahmen zur Legionellenbekämpfung im jeweiligen Gewässersystem zu ergreifen. Übersteigt die Zahl bestimmter Bakterien diesen Grenzwert, sind Sofortmaßnahmen im Zusammenhang mit einer unverzüglichen Abschaltung des jeweiligen Wasserversorgungssystems zu ergreifen.

Andererseits kann die Kalibration auch mit internen Normalen durchgeführt werden, z.B. fluoreszierenden, lumineszierenden oder Raman-aktiven Partikeln, die eine fluoreszierende, lumineszierende oder Raman-Markierung aufweisen, die sich vom optisch detektierbaren Markierungsreagens unterscheidet. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Entwicklung ist eine umfassende Meßzelle für die quantitative Bestimmung von Bakterien:

Ein weiteres Objekt der vorliegenden Entwicklung ist ein Gerät zur mengenmäßigen Bestimmung von Bakterien, umfassend: i) eine Meßzelle, wie vorher angedeutet, ii) Mittel zum Zurückziehen von überflüssigem Etikettierreagenz aus der ersten in die zweite Zelle, iv) Mittel zum qualitativen Auswerten eines Meßsignals, das von den aufgenommenen Bakterien stammt. Der Erfinder kann die Meßzelle und das der Erfindung entsprechende Gerät in einem Methode zur mengenmäßigen Keimbestimmung verwenden, und zwar vor allem in dem der oben genannten Erfaeltigung.

Insbesondere wird die quantitative Legionellenbestimmung in einer Wässerprobe favorisiert. Der Messküvette befindet sich eine Reaktorkammer oder erste Zelle (10) zur Aufbewahrung eines Probevolumens von z.B. 10 ml. Ein Markierungsdepot (12) mit einer vorgegebenen Anzahl von Markierungsreagenzien, vorzugsweise in Trockenform, ist in der ersten Zelle (10) bereitstellt.

In der ersten Zelle (10) befindet sich auf einer der Seiten eine Aussparung ( "14") zur Probenaufnahme. Darüber hinaus ist die erste Zelle (10) über eine Membran (16) mit einer zweiten Zelle (18) verbunden. In der ersten Zelle (10) ist die Membran (16) bakterienundurchlässig, aber für das Kennzeichnungsreagenz ohne Bindung an Bakterien permeabel ausgelegt.

Nach dem Inkubieren mit dem Markierreagenz wird die in der ersten Zelle (10) enthaltene Lösung zur Vermessung in die zweite Zelle (18) eingeleitet. Bakterien, die in der Proben mit einem gebundenen Markierungsreagens vorhanden sind, werden auf der Membran (16) abgeschieden. Ungebundenes Markierungsreagens kann in die Membran (16) eindringen und mit der FlÃ?ssigkeit in die zweite Kammermitte (18) gelangen.

Das auf der Membran (16) abgelagerte Bakterium kann ohne weitere Maßnahmen in Situ vermessen werden. Figur 2 stellt das Resultat einer Spektralmessung an einer Positivprobe für die zu untersuchenden Bakterien, z.B. E. coli oder Lebendzell. dar. Das Aufnehmen des Essensignals wird mit einem Spektralmessgerät durchgeführt, dessen Meßbereich bevorzugt zwischen 350 und 550 nm ist.

Das Spektrometer hat eine spektrale optischen Auflösungsfähigkeit von 0,4-0,1 ns. Die Fluoreszenzsignale der zu untersuchenden Bakterien liegen im Messbereich zwischen 510 und 520 Nanometer (ROI). Zur Bewertung gehört die Bestimmung von zwei Grenzwerten für Keimzahlen von 100 CFU pro 100 ml oder 100.000 CFU pro 100 ml.

Dadurch ist die jeweilige Probenart äußerst hoch belaste. Figur 3 stellt das Resultat der Probenbestimmung mit E. coli Bakterien dar. E. Coliphagen in Verbindung mit dem mineralischen Färbemittel K /VO^Eu (Partikelgröße 5-15 nm) wurden als Markierungsreagenzien eingesetzt. Nach dem Inkubieren mit dem Markierreagenz wurden die in der Probensubstanz befindlichen Bakterien auf einer Membrane in einer Reaktorkammer abgeschieden und dort nachweisbar.

Die Membran wurde mit einem Hochleistungslaser (405 nm/25 mW) gleichmäßig beleuchtet und die bei einer Wellenlängen von 610-615 nm emittierte Strahlung wurde mengenmäßig ermittelt. Der quantitativen Umwandlung des in korrekten Pulsen ermittelten Signales mit der Zahl der Koloniebildungseinheiten (CFU) in der Stichprobe konnte durch vorangegangene Kalibrierung mit Normalproben mit einer bekannter Zahl von E. coli-Bakterien, z.B. im Messbereich zwischen 10-09 Küvetten, begegnet werden.

Zwischen 590 und 600 Nanometern ist noch ein Zeichen des im Färbemittel vorhandenen Wolfram-Markers zu erkennen, das nicht für die quantitative Bestimmung der Bakterien verwendet wird. Bei der in Figur 3 dargestellten Probenbestimmung entstand ein Ausgangssignal, das einer Keimzahl von 10. 030 CFU entsprach. Diese Anzahl von Bakterien konnte durch Tests mit FACS nachgewiesen werden.